临床微生物大讲堂第二讲
测序技术，测序仪及费用问题：
1.WGS与NGS的区别
2.用一代测序仪还是二代测序仪?
3.桑格法可以用吗?
4.WGS所需设备价位多少？
5.WGS用于临床检测的成本和现在第三方服务的收费？
解答：
WGS是至全基因组测序（WholeGenomeSequencing,WGS）的简称，这是一项测序技术的应用，目的是捕获整个细胞中所有的DNA序列。而NGS一般指代（NextGenerationSequencing,NGS）,这是一类不同于桑格法测序（SangerChemistry）原理的DNA测序技术。
原则上，我们可以用任何技术原理的测序仪进行全基因组测序。因为二代测序仪获取单个碱基的读取费用为桑格法（实际使用设备可能是ABIXL）的三万分之一；一次输出的序列数量是一代测序的上千万倍（你没有看错）。一代测序在价格和性能上没有优势，目前基本上都是使用NGS技术平台做WGS应用。
目前的桌面测序仪，每台价格大概在-万人民币（根据政府招标公布信息），其检测通量是一轮十几个/几十个细菌分离株的全基因组测序（视具体的基因组大小）。
在国内，目前没有提供微生物WGS鉴定服务的医学检验所或商业公司。但是有一些提供“科技服务”的测序公司也能提供微生物基因组测序服务，其最低的技术规格，市场价格约为3-5千人民币。根据国外的经验，临床上做一个细菌的WGS费用应该和做2个Xpert检验费用在一个水平上。
WGS实验类型，DNA样本所需输入量，致病性判断问题：
6.WGS是实现分子检测的一项重要挑战,WGS能否鉴别微生物是定植、感染？实验室培养定量标准达到多少才能够检测？
7.直接从样本中检测病原菌，样本中存在多种细菌，怎么确定是否致病菌？
8.宏基因组测序，粪便、血液都直接测
9.测序技术不是问题，微生物室的关键依然是如何确定真正的病原？
10.血培养、结核培养只培养那么短的时间，也不知道里面有没有菌生长，拿去测WGS是不是太浪费呢？
11.请问如果临床有些标本不止长一种菌，怎么确定哪个是菌是致病哪个不致病，确定是致病是不是也要人工分离出纯菌才能用WGS方法检测。
12.WGS的标本应是分离出的纯菌和无菌体液。无菌体液的检测，如是阴性，是否太浪费资源？
13.WGS可以快速、敏感和特异地识别病原体及其耐药谱，目前是否能够利用呼吸道样本中的微生物核酸进行靶标的扩增以鉴定微生物及其耐药性。
解答：
DNA样本来源类型
微生物基因组测序大致分成三种情况：
单分离株全基因组测序（依靠分离培养得到单分离株后抽提DNA进行WGS测序）
是微生物群落全基因组测序（不培养，直接从样本抽DNA进行WGS测序）
扩增子测序，也就是使用PCR或多重PCR的手段先扩增得到靶标序列，然后再使用高通量测序技术对产物进行测序鉴定。
样本DNA起始量
从实践应用上讲，自然是希望能不培养，直接从样本中检测（微生物宏基因组测序）。这里给出一些实际关心的数字，比如DNA起始输入量需要达到什么程度：
依赖培养的WGS
金黄色葡萄球菌（单菌落）测序的DNA输入量：50ng
结核菌，当在MGIT管中的痰培养指示为阳性（培养三天）之后，立即直接从MGIT培养系统中抽提DNA，这个量足够进行下游WGS工作。
宏基因组测序的样本处理方式及DNA输入量尿样处理方式：10ml尿液，×g，30s，沉淀人体细胞；取上清，再离心，×g，5min，沉淀细菌细胞；弃上清，取沉淀的细菌细胞抽提DNA。最终用于建库的输入DNA量约为44-ng。
PCR产物测序参考上述输入量。
致病性细菌菌株判断
应该说，这是最为关键的一点，也是细菌WGS区别于其他分子诊断方法，最具前景的一个方向。
比如，分离出一株大肠杆菌，这类细菌在环境中普遍存在，很多情况下并不具备致病性（可能是污染）；但是有些亚型的大肠杆菌可以是致死性病原，WGS可以区分开么？这里的关键在于WGS实验获得数据的生物信息学分析。
基于特异分子特征识别
从实践上，基于序列信息，我们是根据致病菌的分子特征去识别菌株是否有致病性的（表型实验则是动物模型上做的攻毒试验）。
这些分子特征包括：外毒素，内毒素，双组分系统，黏附因子，各型分泌系统——通过这些分子部件，细菌可以将它们的毒素注入宿主细胞。抗生素抗性基因，质粒以及各型分泌系统可以在共生（北京哪里治疗白癜风不用开又便宜治疗白癜风哪家医院比较好